【circRNA】circRNA的后期验证
1、CircRNA定量验证主要通过分离得到非多聚腺苷酸化RNA或去rRNA后 的RNA、用RNase R去除线性RNA、随机引物反转录成cDNA、RT-PCR扩增、PCR产物跑胶验证、PCR产物测序验证等技术手段，其中最关键的步骤是针对CircRNA设计特异性的RT-PCR引物。
2、CircRNA检测的基本原理是去识别反向剪切的位点(back-splice)，最主要的circRNA类型是外显子来源的，当然，在内含子、间区、UTR区域、lncRNA区域以及已知转录本的反义链区域也都鉴定到circRNA，同一个位点可能形成多个circRNA，每个circRNA可能包含一个或多个外显子。CircRNA的数量从几千到几万都有可能。
3、通过检测backsplicing junction site，即环状RNA特有的反向剪接位点，可以准确判断CircRNA的存在及其序列。 研究方法： qPCR检测：在初步鉴定出CircRNA后，可以通过定量PCR进一步验证其表达水平。
4、circRNA验证推荐使用qPCR，circRNA基于它的成环机制，除backsplice junction位点处不同于线性RNA之外，其他区域跟线性RNA基本都一致。circRNA验证时需针对backsplice junction位点处特异性的设计引物，称之为divergent primer。其他设计上的注意事项与常规PCR引物设计相同。
【CircPrimer】circRNA引物设计
1、以hsa_circ_0046598为例，输入相应的信息后，页面会显示该circRNA的序列信息和染色体位置。点击“circRNA”下的ID或“chr”下的序列，可以看到详细的图形化注释信息，包括外显子和内含子构成等。
CircRNA鉴定及研究方法
1、CircRNA的鉴定及研究方法主要包括以下几种： 鉴定方法： RNase R消化检测：RNase R是一种能够降解线性RNA但对环状RNA无降解作用的酶。因此，通过RNase R处理样品后，检测剩余的RNA，可以初步判断是否存在CircRNA。 RNASeq检测：RNASeq是一种高通量测序技术，能够检测转录组中所有的RNA分子。
2、在研究方法上，RNase R消化检测、qPCR检测、RNA-Seq检测等方法已被广泛应用于CircRNA的鉴定和功能研究。
3、高通量检测：使用高通量检测手段筛选差异表达的circRNA，构建生物信息学图谱辅助筛选。实验验证：通过RTqPCR、northern blotting、RNA荧光原位杂交等方法验证筛选结果。相互作用预测：利用数据库信息预测circRNA与蛋白质、mRNA等的相互作用，鉴定靶基因，分析调控网络及表达调控机制。
4、和过表达策略相反，我们可以采用RNA干扰技术验证CircRNA。对于内含子环化产生的ciRNA，可以根据内含子序列设计相应的siRNA进行干扰，对于外显子环化产生的CircRNA，可以根据back-splice junction位点处序列信息设计siRNA，最后通过divergent primers鉴定CircRNA敲除倍数。